液体活检大突破！一直被忽视的“红细胞”可以更灵敏地检测早期肿瘤

 

2021-03-22

 

Part 1

液体活检的瓶颈

液体活检（liquid biopsy）可从血液里捕捉肿瘤相关信息，凭着样本可及性高、避免组织异质性且可多次取样等优势，在肿瘤的用药指导、复发监测、早筛早诊等领域发挥越来越重要的作用。目前液体活检主要是检测血液中游离的循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）和外泌体（exosome）等来自血清或血浆的标志物，但都存在着两大瓶颈：标志物量少且难以富集，检测灵敏度或特异度不高。这些缺陷也导致了至今为止液体活检仍未成为临床常规应用。

 

Part 2

红细胞携带肿瘤标志物？

现在的液体活检技术在第一步样本处理就会把红细胞去除，因为传统认为红细胞中没有DNA，但红细胞真的一无可用吗？其实红细胞在血液占比高达45%，是血液中数量最多的一种血细胞，存活周期长达120天，红细胞负责将氧气从肺运送到身体各个组织。红细胞作为物质运输的载体，被普遍认为与新陈代谢活跃的癌细胞进行了丰富且频繁的物质交换，表现为红细胞为癌细胞的生长和发育提供氧气和营养，同时也快速带走二氧化碳和癌细胞产生的代谢产物。

 

基于红细胞的上述特性，研究者们提出了假设：在实体瘤形成的早期阶段，由于血管增生，红细胞可能在癌症早期就已经与癌细胞进行了物质交换，并且红细胞带走的或许并不限于代谢产物，还有其他肿瘤来源的物质如核酸。众所周知肿瘤细胞通过外泌体释放核酸，而红细胞的丰度比外泌体高得多，并且已知红细胞可以与癌细胞、外泌体直接相互作用，以及能直接从其环境中吸收核酸，因此红细胞可能通过这些相互作用吸收肿瘤来源的核酸。

 

为了验证这一假设，研究者们经过4年多的探索，在全球范围内首次证明了红细胞可以从肺癌组织中吸收肿瘤来源的突变DNA，并刚刚发表在美国冷泉港实验室、BMJ和耶鲁大学联合运营的预印本平台medRxiv，题为“New Role of Red Blood Cells in Absorption of DNA Bearing Tumorigenic Mutations from Lung Cancer Tissue”。

 

 

来自文献：早期肿瘤细胞和红细胞之间物质交换的示意图

 

Part 3

研究中的全新科学发现

研究团队首先使用了密度梯度法从全血样本中分离出红细胞，并通过显微镜直接观察和流式细胞仪检测的方法，验证了分离出的红细胞纯度接近100%。接着从体外试验和临床研究分别验证了红细胞可以吸收肿瘤来源的核酸。

 

体外试验的结果表明：体外共培养系统中，癌细胞的DNA片段会转移到红细胞中

研究者将红细胞和肺癌细胞系（A549和H1975）进行体外共培养，发现可以从红细胞中检测到与共培养细胞系相同的突变（A549：KRAS突变；H1975：EGFR突变），而在单独培养的红细胞（对照组）中则无法检测到相应突变。

体外试验：红细胞中检测到癌细胞的突变

 

通过临床研究进一步探讨了这种现象的生理学意义：红细胞中检测到癌细胞的特有DNA突变，验证了癌细胞与红细胞之间的物质交换

首先预试验纳入了来自南京鼓楼医院和北京协和医院的28例肺癌患者，I期肺癌有21例，其中包括4例肿瘤大小10mm以下的IA1期患者。研究者分析了肿瘤组织和血液红细胞样本，令人惊喜的是，从肺癌患者的红细胞中分离出了丰富的DNA！特别的是，这部分DNA的长度分布在大于20000 bps和1000至2000 bps两个区间。后者稳定存在于各个肺癌患者的红细胞中，且与已知的各种类型的DNA大小均有较大差异。以大家熟知的短片段DNA——ctDNA为例，其长度分布在170-180bps左右，因此这一新发现的DNA不是从环境中吸附的ctDNA。

 

为了进一步研究在体内情况下是否真的能够获得肿瘤来源的DNA，研究者对28例患者的组织和红细胞中的DNA特定区域进行了NGS测序，发现组织中检测到的EGFR 19del，EGFR L858R，KRAS G12突变，在红细胞中均能相应地检测到，这很令人兴奋，尤其大部分患者还是早期肺癌。但这只是小样本的数据，还需要在更大样本中做进一步的验证。

 

28例患者的组织和红细胞中的DNA突变

 

有趣的是，有一位多原发位点的患者在两个月前后进行了两次连续手术，分别切除了左上肺叶和右上肺叶。研究者采集了第二次手术的组织和红细胞样本，组织L858R检测阴性，而红细胞结果阳性；但根据第三方NGS检测机构的结果显示，第一次手术组织样本L858R也为阳性。该例样本数据说明了红细胞的一些假阳性结果可能是由于肿瘤组织异质性导致，同时还揭示了肿瘤来源的DNA片段可能会保留在红细胞中至少两个月，这与ctDNA的生物学差异很大。

 

为了进一步确认红细胞中携带肿瘤来源的DNA，研究团队采用对检测低频突变具有更高灵敏度的ddPCR技术，分析了鼓楼医院12例红细胞样本。研究者将6例样本直接使用DNA作为模板，另外6例则以DNA扩增后的PCR产物作为模板，两者的ddPCR检测结果与组织结果高度一致。再次证明了红细胞吸收了肿瘤特异性的DNA片段，而且不是由PCR扩增假象引起的。

 

Part 4

突破性研究可能开启液体活检新时代！

研究团队在全球首次证实了红细胞可以吸收肿瘤来源的核酸片段，并且可作为肿瘤特异性的生物标志物，这是液体活检领域的全新突破！

 

该研究显示红细胞检测肿瘤来源DNA的灵敏度远超目前ctDNA的技术平台，尤其在非常早期的肿瘤中优势极其显著。并且红细胞的检测可以克服组织异质性，甚至可能在将来替代组织成为突变检测的金标准。一方面，从红细胞中分离DNA远比从血清中分离DNA要容易得多，用更低的成本更简单的方法就可以获得更多的样本；另一方面，存在于红细胞中的DNA也比游离的ctDNA稳定的多，因为能够积累更多的量便于后续分析。

 

本研究提供了一个全新的样本来源，除了DNA以外，蛋白、脂质、糖、RNA、各种表观修饰均可能通过癌细胞与红细胞的物质交换，成为诊断中的标志物，为后续的研究和应用提供了巨大的想象空间。红细胞与肿瘤的相关性研究的科研价值和转化潜力巨大，有望解决液体活检目前的技术瓶颈，带动千亿市场，开辟基于“红细胞”的液态活检新时代！尤其基于其超高的灵敏度和在早期肿瘤中的表现，在早筛早诊领域极可能大放异彩。